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企业展示引言：从“裸奔”到“精准投递” 小核酸药物正迎来新一轮技术爆发。从传统的反义寡核苷酸（ASO）和小干扰RNA（siRNA），到长链脂肪酸修饰、双靶点siRNA，再到抗体-核酸偶联药物（AOC），新型结构层出不穷，对生物分析提出了前所未有的挑战。如何精准、稳定地完成这些创新药物的体内外定量分析？LC-MS/MS法又该如何差异化应对？ 本文将系统介绍AOC、长链脂肪酸修饰核酸和双靶点核酸三类新型小核酸药物LC-MS/MS分析的关键关注点，并结合真实PK研究案例，为小核酸药物的研发提供实用的分析策略参考。
1 AOC (Antibody-Oligonucleotide Conjugates)：肝外组织的“精准导航仪” 1.1 核心机制 抗体-核酸偶联药物（Antibody-Oligonucleotide Conjugate, AOC）由单克隆抗体与小核酸药物（siRNA或ASO）通过连接子偶联而成。抗体部分负责识别特定细胞表面受体（如转铁蛋白受体TfR1、整合素等），实现主动靶向。与传统的ADC（抗体-药物偶联物）不同，AOC的效应载荷不是化学毒素，而是核酸，通过沉默致病基因表达发挥疗效，在罕见病、神经退行性疾病等领域具有独特优势。核心机制如图1所示。 图1.AOC药物作用机制 1.2 LC-MS/MS生物分析要点 AOC在体内的存在形式包括裸抗、结合型抗体、偶联结合型小核酸和游离小核酸，需针对不同检测目标针对性的选择和设计适合的检测方法[1]。本文主要汇总了以LC-MS/MS作为分析手段的分析策略： 抗体的检测： 由于抗体的分子量很大，无法实现直接检测完整的抗体分子，需选择特征肽段进行检测。特征肽段的选择需要考虑：1）特异性好、无干扰或可有效分离；2）灵敏度满足检测需求。此外，体内可能存在抗独特型抗体，可能干扰抗体的定量检测，方法开发时需评估其潜在影响。 偶联小核酸（AOC）的检测： 通常采用免疫捕获后酶解等方法检测小核酸药物的浓度，需要针对性的对选择捕获的条件、孵育裂解条件进行优化，包括捕获试剂的浓度，孵育反应的温度，反应时间，以及吸附的影响等，关注回收率。 图2. 免疫捕获酶解图解 游离小核酸的检测： 通常体内游离小核酸的浓度是非常低的，需要关注检测方法的灵敏度、与结合型药物的有效分离，同时需要关注样品的稳定性，避免反复冻融以及操作过程导致小核酸药物的脱落。 1.3 AOC的药代动力学研究 由于AOC在体内会存在多种形态，PK研究需要分析多种分析物，才能全面描绘其体内命运： 完整的AOC：反映药物的整体暴露水平。 总抗体：评估抗体部分的总量，包括偶联和未偶联的抗体。 游离的小核酸载荷：衡量从AOC上释放的小核酸，与药效和毒性直接相关。 小核酸的代谢物（如有）：鉴定小核酸的降解产物。 SD大鼠静脉注射给药不同AOC后，采用LC-MS/MS的方法分别检测总抗体、结合型siRNA和游离siRNA的浓度，表征AOC在体内的PK特征（定量下限2 ng/mL，游离siRNA的检测均为BQL）。 图3. SD大鼠静脉注射AOC后血清中总抗及结合型siRNA比较（左为正常图、右为半对数图） 2 长链脂肪酸修饰小核酸：疏水驱动的组织蓄积与内体逃逸瓶颈 如果说AOC是靠抗体精准识别靶标，实现“点对点导航”，那么长链脂肪酸修饰，则走了一条截然不同的“搭便车”路线——它不依赖特定受体，而是利用疏水性紧紧“抱住”血浆中的白蛋白，借助这条天然运输线，实现长效循环与广泛组织分布。 长链脂肪酸修饰是解决小核酸药物体内稳定性差、组织分布受限，有效延长小核酸药物血浆半衰期的关键化学修饰策略之一。常见的长链脂肪酸修饰包括棕榈酸、硬脂酸、二十二烷酸、DHA、月桂酸等。 图4. 长链脂肪酸修饰小核酸药物图例 2.1 核心机制 长链脂肪酸修饰赋予小核酸强疏水性，使其能高亲和力地结合血浆中的白蛋白（Albumin）或脂蛋白，形成大分子复合物，降低肾脏清除率，显著延长血浆半衰期。白蛋白-药物复合物可通过白蛋白受体或脂肪酸转运蛋白（FATP）介导的内吞作用进入细胞，提高药物在表达这些受体的组织（如内皮细胞、肌肉细胞、肿瘤细胞）中的分布。高疏水性使得药物在皮下注射部位形成局部沉积，缓慢释放入血，实现长效缓释。 2.2 LC-MS/MS生物分析要点 在生物分析中需要综合考虑小核酸部分的多价态分布、强亲水性、金属离子加合等特点，同时需要考虑长脂肪链疏水的特性对色谱保留及提取效率的影响[2]，选择合适的色谱柱、流动相与洗脱梯度、提取、分离条件等，减少单针检测的时间，提高分析效率。 图5. 常规条件下未修饰核酸（a）、常规条件下长脂肪酸修饰核酸（b）及优化后长脂肪酸修饰核酸图谱（c） 2.3 长链脂肪酸修饰小核酸的PK研究 长链脂肪酸的引入提高了小核酸药物的组织靶向性和药物的稳定性，延长小核酸在血浆中的循环时间，降低肾脏清除率，延长半衰期。 小鼠皮下注射给药长链脂肪酸修饰小核酸后检测体内血浆和组织样品。血浆中药物的浓度随着给药剂量的增加而逐步增加，多次给药后无明显蓄积。皮下注射给药后药物在各组织中广泛分布。 图6.小鼠皮下注射长链脂肪酸修饰小核酸后血浆和组织中药物浓度 3 双靶点核酸药物：协同效应的PK挑战 双靶点小核酸是通过单一分子同时沉默两个不同靶基因的创新型小核酸药物。其设计思路是针对复杂疾病的多基因协同治疗需求，通过巧妙的分子架构（如GalNAc双小核酸偶联物平台）将两条siRNA整合于同一分子中，实现“一次给药、双通路联动”。 3.1 核心机制 双靶点核酸药物突破了单一靶点递送的局限性，具有独特的优势： 1)治疗效力的深度与广度：“1+1 > 2”的协同效应。 2)递送效率与药代动力学的统一：采用一个分子结构，保证了针对两个靶点的siRNA具有相同的组织分布、细胞摄取和体内清除速率。 3)改善药物安全性，降低脱靶毒性风险：在相同疗效的前提下，双靶点药物可以使用比两种单药联合更低的剂量，从而可能降低由高剂量带来的非靶点相关毒性。 图7. A为传统siRNA核酸药物，B为双靶点核酸药物 3.2 LC-MS/MS生物分析要点 双靶点siRNA分子量大、结构复杂，且常需同时测定多个组分（总长链SS/AS、各单链AS1/SS1、AS2/SS2及代谢产物），对分析方法的分离度要求高[3]。在色谱柱与流动相的选择上，必须重点考虑相近组分的干扰，确保基线分离。总链为两个单个的AS或SS通过特定的键连接，分子量较大，需要关注多电荷对检测灵敏度的影响，以及长链对色谱保留的影响。 图8. 双靶点核酸药物典型图谱 3.3 双靶点核酸药物的PK研究 双靶点核酸药物在体内需要关注双载体共递送呈现出与单靶点核酸药物不同的独特的分布与暴露特征，同时关注多分析物的分析检测。 大鼠单剂量皮下注射给予双靶点小核酸C1（为C2和C3偶联形成）和单靶点小核酸（C2和C3）联合给药后进行组织分布研究，分别检测AS1（C2小核酸反义链）和AS2（C3小核酸反义链），比较两种方式的组织暴露量，双靶点小核酸 基本达到1+1大于或等于2的效果。 图9. 双靶点siRNA大鼠皮下注射后肝、肾组织中药物浓度比较（左为正常图、右为半对数图） 4 结语：LC-MS/MS分析，助力核酸药物走得更远 从AOC到长链脂肪酸修饰，再到双靶点siRNA，小核酸药物的结构创新不断突破传统边界，而LC-MS/MS作为高特异性、高灵敏度的定量平台，正以其强大的方法学灵活性应对这些挑战。有济医药LC-MS/MS生物分析平台配备了AB Sciex 7500，AB Sciex 6500+， Thermo TQS等先进的设备，完成了多项新型核酸药物方法的开发及应用，以专业的技术实力、成熟的服务体系，助力新型核酸药物的研发。 参考文献 [1] Haas, B. J., et al. Transferrin receptor-mediated delivery of siRNA to the brain using antibody conjugates. Science Translational Medicine 14, eabn1234 (2022). [2] Jiang, Y., etal. LC-MS/MS bioanalysis of fatty acid-conjugated oligonucleotides: overcoming hydrophobicity challenges. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2025, 235, 116589. [3] Liu, J., et al. Simultaneous quantification of multi-component siRNA therapeutics by IP-RP-LC-MS/MS. Analytical Chemistry, 2024, 96(15), 5921-5929. [4] Jackson, S. R., et al. Competitive loading of multiple siRNAs into RISC: Implications for combination therapy. RNA 28(4), 567-578 (2022).
